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肺中的支氣管經(jīng)多次反復(fù)分枝成無(wú)數(shù)細(xì)支氣管，它們的末端膨大成囊，囊的四周有很多突出的小囊泡，即為肺泡。肺泡或肺的氣體交換表面由 I 型肺泡上皮(ATⅠ,AT1)、II型肺泡上皮(ATⅡ,AT2)和微血管內(nèi)皮細(xì)胞組成。
其中，ATⅠ細(xì)胞又稱小肺泡細(xì)胞，其主要作用是參與構(gòu)成氣血屏障、進(jìn)行氣體交換；ATⅡ細(xì)胞又稱大肺泡細(xì)胞，是肺泡上皮中的祖細(xì)胞，具有很強(qiáng)的增殖和分化潛能，可分化成ATⅠ，在維持肺臟穩(wěn)態(tài)以及肺損傷修復(fù)過(guò)程中起著至關(guān)重要的作用。
圖1 肺泡模式圖
圖2 肺泡細(xì)胞的外觀：上皮I型細(xì)胞(I)、上皮II型細(xì)胞(II)和毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞(E)(bar=4μm)
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什么是Ⅰ型肺泡上皮細(xì)胞？
傳統(tǒng)的觀點(diǎn)認(rèn)為ATⅡ是肺泡上皮中具有生物學(xué)活性的細(xì)胞，而終末分化的ATⅠ只是被動(dòng)地參與氣血屏障的形成，不增殖，也不具有可塑性。但最近的研究發(fā)現(xiàn)ATⅠ可能不只是傳統(tǒng)意義上的終末分化細(xì)胞，而具有多樣的生物學(xué)功能，并在損傷修復(fù)過(guò)程中發(fā)揮一定作用[3]。雖然ATⅠ數(shù)量只占全肺總細(xì)胞數(shù)的8%，但卻覆蓋了95%~98%的肺泡表面積，是其中最大的細(xì)胞之一，平均體積為1,764 μm3。ATⅠ參與氣血屏障的形成，對(duì)于正常的換氣功能非常重要。由于ATⅠ易破裂，缺少生物學(xué)標(biāo)記，分離相對(duì)困難，因此目前針對(duì)ATⅠ的研究主要采用由ATⅡ分化而來(lái)的ATⅠ樣細(xì)胞，但其生物學(xué)特性與ATⅠ細(xì)胞存在一定差異。
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什么是Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞？
Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞(typeⅡ alveolar epithelial cells，ATⅡ)是由內(nèi)胚層衍生的多功能極化上皮細(xì)胞，存在于成年哺乳動(dòng)物的肺部遠(yuǎn)端，與Ⅰ型肺泡上皮細(xì)胞偶聯(lián)鑲嵌排列，形成肺泡囊，參與呼吸膜的形成。ATⅡ雖僅占肺泡表面積的7%，但卻占實(shí)質(zhì)肺泡細(xì)胞總數(shù)的16%，平均體積為I型肺細(xì)胞的一半，可通過(guò)分泌大量的表面活性物質(zhì)，從而減低肺泡表面張力。另外，其還可參與肺部的炎癥反應(yīng)、免疫反應(yīng)、細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)調(diào)節(jié)和損傷修復(fù)等多種生物學(xué)活動(dòng)。
Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞的鑒定：
肺表面活性蛋白C(surfactant protein C,SP-C)基因是目前被發(fā)現(xiàn)的唯-一僅在肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞中表達(dá)的肺表面活性蛋白基因，也是鑒定ATⅡ細(xì)胞最-常用的標(biāo)記物。此外，至少對(duì)于小鼠，有報(bào)道稱，一部分SP-C(+)ATⅡ細(xì)胞也被發(fā)現(xiàn)表達(dá)低水平的Clara/Club細(xì)胞基因Scgb1a1/CC10，這些雙陽(yáng)性細(xì)胞能夠分化成ATⅠ細(xì)胞。因此，CC10的共存表達(dá)并不絕對(duì)排除作為ATⅡ細(xì)胞的識(shí)別[2]。
圖3 Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞的鑒定
圖3[A]:從分化的人類胎兒外植體中制備的人類ATⅡ細(xì)胞在培養(yǎng)4天后使用尼羅紅進(jìn)行脂質(zhì)染色以識(shí)別層狀體(LB);"N"=原子核。
圖3[B]:來(lái)自正常成人肺的人ATⅡ細(xì)胞的透射電子顯微照片，顯示含有致密核心顆粒的形成良好的 LB (LB→)。此外，還鑒定出了多泡體（MVB）和微絨毛（mv）。
圖3[C]:對(duì)[A]中制備的人ATⅡ細(xì)胞單層進(jìn)行免疫組化，使用抗NPROSP-C(紅色)和DAPI(細(xì)胞核)對(duì)proSP-C進(jìn)行染色，顯示點(diǎn)狀胞質(zhì)染色，表明proSP-C后高爾基體運(yùn)輸?shù)絃B。
圖3[D]:使用新鮮分離的小鼠ATⅡ的proSP-C抗血清進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡，顯示21 kD proSP-C初級(jí)翻譯產(chǎn)物(箭頭)和低分子量加工中間體(括號(hào))。
圖3[E]:使用SP-B抗血清對(duì)按照A和C中制備的兩種單獨(dú)的人ATⅡ細(xì)胞制劑進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡。proSP-B初級(jí)翻譯產(chǎn)物(粗箭頭)、25kD 中間體(細(xì)箭頭)和成熟SP-B(括號(hào))被識(shí)別。此外，二聚體成熟的SP-B(箭頭)也出現(xiàn)了。[2]
原代肺泡上皮細(xì)胞的分離培養(yǎng)：
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取完-全無(wú)血液殘留的肺臟組織
2
消化肺組織
常用消化酶: 胰蛋白酶、彈性蛋白酶、膠原酶;
經(jīng)支氣管將酶灌注到完整的肺中消化，或把肺組織剪碎放入消化液中消化（前者比后者更有效）。
3
分離純化細(xì)胞
原代肺泡上皮細(xì)胞分離純化主要方法：
01
密度梯度離心法
不同細(xì)胞的沉降系數(shù)不同，在密度梯度離心中細(xì)胞所處的位置也相應(yīng)不同。用ficoll或percoll不連續(xù)梯度離心法分離肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞。
02
流式細(xì)胞技術(shù)法
根據(jù)不同細(xì)胞之間的熒光差異，用熒光物質(zhì)標(biāo)記篩選。肺泡上皮細(xì)胞內(nèi)含有豐富的脂類物質(zhì)，用親脂性熒光素標(biāo)記，可以得到純度很高的細(xì)胞。該方法分離細(xì)胞的產(chǎn)量很低，但純度極-高。
03
免疫黏附法
不同細(xì)胞的沉降系數(shù)不同，在密度梯度離心中細(xì)胞所處的位置也相應(yīng)不同。用ficoll或percoll不連續(xù)梯度離心法分離肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞。
04
貼壁選擇法
肺泡上皮細(xì)胞完成貼壁的時(shí)間不同，利用這種特性在肺泡上皮細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)做篩選。
●參考文獻(xiàn)●
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